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產(chǎn)品描述

本試劑盒用于檢測細(xì)胞凋亡早期的發(fā)生，其中Annexin V為胞內(nèi)蛋白膜聯(lián)蛋白家族成員，以鈣離子依賴的方式選擇性與磷脂酰絲氨酸(PS)結(jié)合。

PS正常分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細(xì)胞都會(huì)把PS外翻到細(xì)胞膜外側(cè)。用帶有FITC標(biāo)記的Annexin V，即Annexin V-FITC，就可以通過流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測到PS的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種可對(duì)DNA染色的細(xì)胞核染色試劑，在嵌入DNA后釋放紅色熒光。PI不能穿透完整的細(xì)胞膜，但可以穿透壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞。因此，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時(shí)，PI被排除在活細(xì)胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/PI-）外，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時(shí)被FITC和PI結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/PI+）。

FITC最大吸收波長為490nm，發(fā)射波長為525nm，PI-DNA復(fù)合物的最大吸收和發(fā)射波長分別為535nm和615nm。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

圖1. 在凋亡激活劑2(MB4124)孵育C6細(xì)胞（大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞）1.5小時(shí)后，使用我公司Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測染色效果圖。僅被綠色熒光染色的為凋亡前期細(xì)胞，被綠色和紅色雙染的是凋亡晚期或壞死細(xì)胞。

圖2. 使用我公司Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒染色后流式細(xì)胞儀檢測效果圖。A549細(xì)胞（人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞）用100μM凋亡激活劑2(MB4124)作用5小時(shí)后，未經(jīng)染色(A)、僅用本試劑盒中的PI進(jìn)行染色(B)、僅用本試劑盒中的Annexin V-FITC進(jìn)行染色(C)、用本試劑盒中的Annexin V-FITC和PI進(jìn)行雙染(D)。從圖中可以看出，未經(jīng)染色的是雙陰性細(xì)胞(A)，僅PI染色后出現(xiàn)了預(yù)期的PI染色陽性的細(xì)胞，僅Annexin V-FITC染色出現(xiàn)了預(yù)期的Annexin V-FITC染色陽性的細(xì)胞，Annexin V-FITC和PI雙染出現(xiàn)了預(yù)期的僅Annexin V-FITC染色陽性的早期凋亡細(xì)胞和雙陽性的晚期凋亡細(xì)胞。出現(xiàn)的非預(yù)期的細(xì)胞點(diǎn)完全在許可的誤差范圍內(nèi)。實(shí)測數(shù)據(jù)可能會(huì)因細(xì)胞類型、細(xì)胞凋亡情況、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

操作步驟

1. 樣品染色

1)      將Binding Buffer（10×）稀釋成1×Binding buffer工作液備用（1ml Binding Buffer（10×）需加入9ml無菌去離子水）。

2)      對(duì)于懸浮細(xì)胞，500-1000g離心5min收集細(xì)胞。

對(duì)于貼壁細(xì)胞，要用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，胰酶消化時(shí)間不宜過長或過短，最好是在輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時(shí)，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，將細(xì)胞輕輕吹打下來，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，500-1000g離心5min收集細(xì)胞。

3)      收集細(xì)胞后，加入預(yù)冷PBS溶液輕搖或用移液器輕柔吹打洗滌，離心收集細(xì)胞，共洗滌兩次。

4)      在細(xì)胞沉淀中加入1×Binding buffer工作液，重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度達(dá)到1×10⁶ cell/ml。

5)      吸取100μl細(xì)胞懸液（細(xì)胞總數(shù)為1×10⁵ cell）至一新管中，加入5μl Annexin V-FITC和5-10 μl PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。

2. 樣品檢測

1)      流式細(xì)胞儀檢測：

建議設(shè)置正常細(xì)胞、PI單染和Annexin V-FITC單染3個(gè)對(duì)照組，正常細(xì)胞組可作為熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。若十字門的位置不易設(shè)定，可采用經(jīng)凋亡誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行設(shè)定。結(jié)果可用CellQuest等軟件進(jìn)行分析，繪制雙色散點(diǎn)圖（two-color dot plot），F(xiàn)ITC為橫坐標(biāo)，PI為縱坐標(biāo)。Annexin V-FITC和PI聯(lián)合使用時(shí)，活細(xì)胞僅有很低強(qiáng)度的背景熒光，早期凋亡細(xì)胞僅有較強(qiáng)的綠色熒光，晚期凋亡細(xì)胞有綠色和紅色雙重?zé)晒狻?

2)      熒光顯微鏡檢測：

染色孵育后涂片，顯微鏡下觀察。使用熒光顯微鏡上的藍(lán)光和綠光通道分別觀察FITC和PI。被Annexin V-FITC結(jié)合的細(xì)胞顯示漿膜上有綠色光環(huán)。喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞，細(xì)胞核顯示紅色，膜上有綠色光環(huán)。

保存條件

2-8℃避光保存，一年有效。Annexin V-FITC不可冷凍。

注意事項(xiàng)

1.   可立式離心管內(nèi)試劑在開蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時(shí)液體灑落。

2.   Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）是光敏物質(zhì)，在保存與操作時(shí)請(qǐng)注意避光。

3.   在細(xì)胞洗滌的最后一步，請(qǐng)盡量將上清棄凈，以免PBS殘留影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4.   為獲得準(zhǔn)確試驗(yàn)結(jié)果，建議樣品在Annexin V-FITC染色后1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分析。

5.   為了您的安全和健康，請(qǐng)穿戴實(shí)驗(yàn)防護(hù)服、手套、口罩等必要的防護(hù)裝備。